RESUMO. A engenharia genética ampliou as possibilidades do melhoramento genético vegetal, apoiando ideais de sustentabilidade. A Agrobacterium tumefaciens é o sistema de transformação preferido, uma vez que permite a produção de plantas transgênicas com maior estabilidade na expressão gênica e na herdabilidade. A Agrobactéria e o tecido vegetal devem ser co-cultivados em condições que permitam a transferência de genes. Este estudo teve como objetivo avaliar como o tempo e a temperatura durante o co-cultivo afetam a transformação de embriões imaturos de milho do híbrido Hi-II (genótipo modelo) e da variedade brasileira BR 451 com A. tumefaciens EHA101:pTF102. O plasmídeo pTF102 carrega o gene repórter uidA permitindo que a transformação transiente seja prontamente verificada pelo ensaio histoquímico de GUS. O aumento do período de co-cultivo de três para cinco dias a 20°C resultou num maior número de embriões GUS positivos e maior número de pontos azuis por embrião na variedade brasileira BR 451, indicando uma melhor transferência do T-DNA da bactéria para as células do explante alvo. Esta condição elevou o nível de resposta da BR 451 chegando a coincidir com o nível de resposta do controle Hi-II, indicando que esta variedade brasileira é adequada para transformação genética.

ABSTRACT. Genetic engineering has amplified the possibilities of crop breeding and supported sustainability ideals. Agrobacterium tumefaciens is the preferred transformation system, since it produces transgenic plants with more stable transgene expression and inheritance. The agrobacteria and plant tissue must be co-cultivated in conditions that allow gene transfer. This study aimed to evaluate how co-cultivation time and temperature affect the transformation of immature maize embryos of the Hi-II hybrid (model genotype) and the Brazilian BR 451 variety with A. tumefaciens EHA101:pTF102. The pTF102 plasmid carries a uidA reporter gene that enables transient transformation to be quickly verified by GUS histochemical assays. Increasing the co-cultivation period from three to five days at 20°C resulted in a higher number of GUS positive embryos and blue spots per embryo in the BR 451 Brazilian variety, indicating better bacterial T-DNA transfer into the target explant cells. This condition raised the BR 451 response level to match the response level of the Hi-II control genotype, indicating that this Brazilian variety is suitable for genetic transformation.

RESUMO: A introdução de genes de forma assexual por meio da engenharia genética tem ampliado as possibilidades do melhoramento genético vegetal. No entanto, devido principalmente a baixa resposta in vitro, a transformação genética tem se limitado a poucos genótipos das espécies de interesse agronômico. Visando estabelecer protocolo de transformação genética da variedade de milho BR 451 via Agrobacterium tumefaciens, foi estudada a capacidade de regeneração de plantas in vitro a partir de calos embriogênicos cultivados em três meios de regeneração contendo diferentes reguladores de crescimento. Também foi avaliado o efeito do estresse de temperatura na transformação de embriões imaturos com a A. tumefaciens EHA 101portadora do plasmídeo pTF102 que contém os genes uidA e bar. Para tal, três tratamentos foram aplicados aos embriões da variedade BR 451 e do híbrido Hi-II (controle) durante a infecção com a agrobactéria: (a) infecção em 25oC; (b) infecção a 40oC; (c) pré-tratamento de 40oC por cinco segundos seguido por infecção em 25oC. A transformação foi avaliada mediante a expressão do gene uidA e a formação de calos resistentes ao herbicida Bialaphos®. A infecção de embriões a 40oC aumentou a transformação genética em Hi-II, mas não em BR 451. A adição de reguladores de crescimento no meio de regeneração não incrementou o número de plantas regeneradas.

ABSTRACT: The asexually gene introduction by genetic engineering has brought enormous possibilities to innovate plant breeding. However, principally because of the low in vitro response, genetic transformation has been restricted to only certain genotypes of agronomically significant species. With the objective of establishing a protocol for genetically transforming the Brazilian BR 451 maize variety through Agrobacterium tumefaciens, it was studied the capacity of plant regeneration in vitro from embryogenic calli cultivated in three regeneration media, each having different growth regulators. It was also evaluated the temperature stress effect on the transformation of the immature embryos with A. tumefaciens EHA 101 containing the plasmid pTF102 with uidA and bar genes. The BR 451 variety embryos and those of the Hi-II hybrid (control) were exposed to three treatments applied as they were being infected with the agrobacteria (a) infection at 25°C; (b) infection at 40°C; (c) pretreatment at 40°C for 5 seconds followed by infection at 25°C. Transformation was determined by uidA gene expression and through the callus resistant to the herbicide Bialaphos® formation. Embryos infected at 40°C showed a higher degree of genetic transformation in the Hi-II, although the same was not noted in BR 451. When growth regulators were added to the culture medium the number of regenerated BR 451 plants showed no increase.

A embriogênese somática e regeneração de plantas in vitro são processos indispensáveis para obtenção de plantas transgênicas de milho. Explante, genótipo e meios de cultura são fatores determinantes destes processos. O explante embrião imaturo e o genótipo americano Hi-II tem sido amplamente empregados para a obtenção de plantas geneticamente modificadas nesta espécie. No entanto, é desejável a utilização de explantes mais prontamente disponíveis, bem como o desenvolvimento de protocolos de transformação genética para genótipos produtivos e adaptados às condições locais. Objetivou-se neste trabalho avaliar o explante pendão imaturo quanto à produção de calos embriogênicos e regeneração de plantas em genótipos sulbrasileiros de milho para o uso em experimentos de transformação genética. Pendões imaturos de cinco híbridos foram cultivados em diferentes meios de indução de calos, sendo avaliada a freqüência e massa fresca dos calos embriogênicos. A freqüência dos calos embriogênicos foi influenciada pelo genótipo e a massa fresca foi influenciada pelo genótipo e meio de cultura. Na regeneração de plantas foi contabilizado o número de brotos, plântulas completas e plantas aclimatizadas e férteis. Foi possível identificar tratamentos que produziram calos embriogênicos de longa duração com capacidade de regeneração de plantas a partir de pendão imaturo de genótipos sulbrasileiros.

Somatic embryogenesis and in vitro plant regeneration are fundamental processes in the obtainment of transgenic maize plants. Explant, genotype and culture medium are determining factors in these processes. Immature embryo explants and the American Hi-II genotype have been widely employed to acquire genetically modified plants in this species. However, the use of more readily available explants is desired as well as the development of genetic transformation protocols for productive genotypes adapted to local conditions. This study provides an evaluation of immature tassel explants in relation to embryogenic callus production and plant regeneration in South Brazilian maize genotypes for their use in genetic transformation experiments. Immature tassels from 5 hybrids were cultivated in different callus-induction media. The frequency and the fresh mass of embryogenic calli were evaluated. The frequency was influenced by genotype, and the fresh mass was influenced by genotype and culture medium. In plant regeneration, shoots, complete seedlings and acclimatized and fertile plants were quantified. Treatments producing long term embryogenic calli from immature tassels of South Brazilian genotypes with the capacity to regenerate were identified.